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流式細胞儀使用方法

一．開機程序

1.檢查穩(wěn)壓器電源，打開電源，穩(wěn)定5分鐘。

2.打開儲液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

3.將FACSCalibur開關(guān)打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應(yīng)是STANDBY，預(yù)熱5－10分鐘。排出過濾器內(nèi)的氣泡。

4.如果需要打印，打開打印機電源。

5.打開電腦,等待屏幕顯示出標(biāo)準的蘋果標(biāo)志。

6.執(zhí)行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

7.分析樣品時，先用FACA Flow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。

做過分選后，每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統(tǒng)，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止

后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

二.預(yù)設(shè)獲取模式文件(Acquisition Template Files)

1.從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當(dāng)?shù)膞軸和y軸參數(shù)。

3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3BD Applications CELLQuest Folder EXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調(diào)用。

※本計算機中已設(shè)定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3BDApplications CELLQuest EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標(biāo)志分析。

三.用CELLQuest進行儀器的設(shè)定和調(diào)整

1.從蘋果畫面中選取CELLQuest，進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵：＋B)進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

3.從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數(shù)據(jù)時隨時調(diào)整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。

4.在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數(shù)選擇適當(dāng)?shù)谋对瞿Ｊ?amplifier mode)：線性模式Lin或?qū)?shù)模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，F(xiàn)SC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數(shù)模式Log測量；分析細胞DNA含量時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3皆以Lin進行測量，且DDM Param選擇FL2；分析血小板表型時，F(xiàn)SC，SSC，F(xiàn)L1，F(xiàn)L2，F(xiàn)L3等均以Log進行測量。

5.放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設(shè)定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

6.在Acquisiton 3 Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細胞。在以下的儀器調(diào)整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調(diào)整效果。未完全調(diào)整好之前不要去掉SETUP前的“

7.在Detectors/Amps對話框中，調(diào)整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調(diào))與Amp Gains(細調(diào))，使樣品信號出現(xiàn)在FSC-SSC點圖內(nèi),且三群細胞合理分布。

8.在Threshold 對話框中選擇適當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定Threshold，并調(diào)整Threshold的高低，以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質(zhì)量。

9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區(qū)域)，并在靶細胞周圍設(shè)定區(qū)域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調(diào)整更為容易。

10.Detectors/Amps對話框中，調(diào)整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據(jù)所用的熒光陰性對照樣品調(diào)整細胞群，使之分布在正確的區(qū)域內(nèi)。

11.在Compensation對話框中，根據(jù)所用的調(diào)補償用標(biāo)準熒光樣品調(diào)整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如，應(yīng)該為FL1+FL2-的細胞群卻分布在FL1＋ FL2＋區(qū)域內(nèi)，則需調(diào)大FL2－，？％FL1中的“？”并從FL1-FL2點圖中觀察新的調(diào)整是否恰當(dāng)

12.在Status對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW；Laser current:正常值為6Amps左右。

13.調(diào)整好的儀器設(shè)定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調(diào)出使用，屆時只需微調(diào)即可。

※本計算機中已有三個名叫儲存于FAC Station G3/BDApplications/CELL Quest Folder/IMM-InstrSettings及FAC Station G3/BD Files/Instrument Settings Files/CalibFile和Mast-Cell-Set的參數(shù)文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。

四.通過預(yù)設(shè)的獲取模式文件進行樣品分析：

1.從蘋果標(biāo)志中選擇CELLQUEST，新視窗出現(xiàn)后從File指令欄中選擇Open，打開預(yù)設(shè)的獲取模式文件。

2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進行電腦和儀器的連機。將出現(xiàn)的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對話框中選擇Open以調(diào)出以前存儲的相同實驗的儀器設(shè)定，按Set確定。

4.在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數(shù)，參數(shù)，信號道數(shù)。其中Resolution在做細胞表面標(biāo)志時選擇256，做DNA時選擇1024。Parameter Saved…則根據(jù)不同的檢測對象選擇不同的參數(shù)。

5.在Acquire指令欄中，選擇Parameter Deion，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數(shù)的標(biāo)記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測參數(shù)。一般本儀器獲取的數(shù)據(jù)按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3/BD Applications/CELLQuest/IMM 和DNA 文件夾中。文件根據(jù)日期命名。

6.在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察events計數(shù)。

7.將樣品試管放至檢測區(qū)，在Acquire Control對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。

8.微調(diào)儀器設(shè)定，待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話框中Pause，Abort，開始正式獲取信號，存儲數(shù)據(jù)。

9.當(dāng)一定數(shù)目的細胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數(shù)據(jù)。重復(fù)步驟7，繼續(xù)分析下一個樣品，直到所有的樣品數(shù)據(jù)分析完畢。當(dāng)所有樣品分析分析完畢，即，換上三蒸水，并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態(tài)，以保護激光管。

五.關(guān)機程序：

1.從File中選擇Quit，退出軟件，選擇Don’t Save至蘋果屏幕。

2.用4mL，1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去約2mL，在將樣品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分鐘(內(nèi)管吸去2mL)。

3.改用三蒸水4mL作樣品，同上處理。

4.按Prime三次。

5.此時儀器自動轉(zhuǎn)為STAND-BY狀態(tài)，換2mL三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態(tài) ，10分鐘后再依次關(guān)掉計算機、打印機、主機、穩(wěn)壓電源，以延長激光管壽命，并確保應(yīng)用軟件的正常運行。

6.填寫使用登記表。

寫好記錄弄好